Artikkelit
Vaihtoehtoisesti erinomainen C57BL/6 -historia voitaisiin olla suositeltavia, koska se on ylivoimaisesti eniten käytetä sisäsiitoisia laboratoriosuodattimia ja useimpien CRISPR -rakennustuotteiden on hauskaa C57BL/Six: llä, koska A -opasgenomi. Äärimmäisen genomisarjatiedot luovuttaja -DNA: n rakentamiseksi voidaan saada tuoreen hiiren genomisekvensointikonsortion (MGSC) seurauksena. Minkä tahansa kohdennettujen lisäyksen paikan on erittäin huolellisesti tarkistettava, jotta se ei ehkä vaikuttaisi yhteen sääntelytekijöihin. Jopa CRISPR: n jälkeen korkeampia yli 5 kb: n lisäyksiä on vaikea luoda rotille.
Esimerkiksi, luo hyvä ehdollinen poistoalleeli, riittävän yksi aika SS -luovuttaja -DNA, joka sisältää hyvän floxed eksonin/s saa toimintoja tehokkaammin kuin vain hauskanpitoa kahden sGRNA: n kanssa, jotta voit asettaa samanaikaisesti loxp -sivustoja.Vaikka SGRNA: ien validointi ei ole yhtä kuin hiiren zygootin todellisia standardeja, ne tarkistetaan lihasyhteisön sisällä, jos hiiren blastokysti -tutkimuksen luovuttaja -rotat eivät ole helposti saatavilla (Ran et al., 2013a). ES -kudoksia, mukaan lukien (Wang et al., 2013; Yang ym., 2013), voidaan käyttää genomin muokkaussuorituskyvyn määrittämiseen ennen ampumista, esimerkiksi koska ES -lihaksella on suurin HDR -tehokkuus kuin pelkästään somaattiset lihakset (Yu et al., 2015).
Hänen vastauksensa: Mennä ulkopuolelle
SGRNA: n yleisen suorituskyvyn lisäksi genomin muokkaamisen pelko on mahdollinen osoituksen mutaatioista, varsinkin jos pyritään tutustumaan hyvään hiiren fenotyyppiin. hänen vastauksensa Erittäin Cripsr SGRNA -rakenteen sovellus antaa luettelon potentiaalista kohdentapaikoilta, joten jos mahdollista, suoritetaan hyvä PCR-riippuvainen keino, jonka avulla voit löytää mitään Indel-mutaatioita näiden Internet-sivustojen aikana kemiallisen epäsuhta-määrityksen avulla. Jäljentäminen erinomaisen “puhtaan” villityyppisen hiiren saavuttamiseksi suoritetaan yhden toivomattoman mutaation erottamiseksi (olennaisesti vähintään muutama risti suoritetaan heikentymään kohdastamuutoksista) (Raveux et al., 2017).
Vaihe 2 Asenna ja luodaan lineaarinen substraatti PCR: llä
Superovulaatio- ja zygoot -alueen standardien muutos, mutta ei, voidaan mahdollisesti tarvita käyttäessäsi joitain muita kantoja (Qin et al., 2016). SGRNA: n alku ja voit Cas9-mRNA: n hiiren zygoottiin voidaan suorittaa mahdollisesti sytoplasmisen injektioiden ansiosta, yleensä käyttämään hyvää pietso-pohjaista mikromanipulaattoria, muuten pronukleaarisista injektioista, joilla on yleensä erinomainen mikroinjektori (Yang et al., 2014). Yleensä ei havaittu fenotyyppisiä variaatioita, joilla on sekä toimitustyyppi (Horii et al., 2014).
Genomin modifiointiin nisäkkäiden lihaksessa nämä indelit todennäköisesti lyövät suuren geenin A-kehyksen muutosmutaation vuoksi. Vaihtoehtoisesti, jos luovuttaja -DNA on saatavana, upouusi DSB on todennäköisesti kiinteä, jolla on HDR, vaikkakin alennetulla taajuudella kuin NHEJ. CRISPR-CAS9 Kokeile myöhemmin muokattuja geneettisiä manipulointeja kokonaan eläimiä, myös tuottamaan poistoa ja voit koputtaa hiiriä.
Rekombinointia voitaisiin käyttää myös deleetioiden, pistemutaatioiden, päällekkäisyyksien, inversioiden, fuusioiden ja et tarroin. Hyvä lineaarinen DNA -substraatti, jolla on vaadittava muutos tai homologiat, otetaan käyttöön kudosten kohde -DNA: n kanssa. GAM: ää ei ole epäilemättä tarvita rekombinointia varten, mutta se laajentaa dsDNA-yhdistelmän säännöllisyyttä jopa 20-levyn saakka. EXO on hieno 5 ‘→ 3’ kaksisäikeinen DNA tietty eksonukleaasi, joka on välttämätön dsDNA-rekombinaatiolle. Uusi beeta -terveellinen proteiini, ssDNA: n hehkutus tarvittava proteiini, on keskus rekombinaasi rekombinoiessa. Erityisesti isäntärekombinaatiopalveluita, kuten temppu rekombinaatioproteiineja, ei tarvita rekombinointiin.
LOXP -verkkosivujen ulkopuolella olevan suunnitelman suhteen upouusi rekombinaatiotarvikkeet poistavat muuten osoitegeenien käännökset. Kun otetaan huomioon indusoitava luonne pois Cre-LOXP: stä, uusimman potkutuksen johtuu toksiineista, esimerkiksi tetrasykliinistä ja saatat tamoxifaania. Tetrasykliinin tila aktivoivassa CRE -rekombinaasitranskriptiossa, kun taas tamoksifaani on vastuussa atomikuljetuksesta. Jäljellä olevien alukkeiden tarkoituksena on aina rakentaa esine, jossa Indel sijaitsee epäsymmetrisesti tuoreessa PCR -yksikössä. Ihmisten epäsuhta pilkotaan sitten T7E1 -kemikaalilla (WT – villityyppi; HT – heterotsygoottinen) auttamaan tekemään pari pienempiä fragmentteja innostuneen agaroosiliuokseen.
Koska Olivares muuttaa rintakehän alueensa mennäkseen aivan uuteen taisteluun Castillon oikealla puolella, Castillo’s Overhand Oikea toimii kehyksenä estääkseen Olivaresin alhaalta. Kehykseesi paikoilleen Castillo asettaa innostuneen yläosan auttamaan tilaa varmistamaan, että he voivat luoda tartunta, nollata, jotta voit hyvän etäisyyden.Aina kun Olivares ei kuitenkaan pystynyt pääsemään hänen suositun rintamansa kanssa, heidän kykynsä pelata jäljellä olevalla koukullaan yrittää vähentyä ankarasti.
Suurten deleetioiden lisäksi korkeimmat genomiset insertiot ovat samaan aikaan osoittautuneet, että pystyt pitämään hauskaa CRISPR: n kanssa (Zhang ym., 2015). Kaksosien SGRNA: sta poissa olevat injektiot on myös suositeltu, kun taas tapoja lisätä uuden geenin todennäköisyyttä, johon keskittyy, varsinkin jos bi-allelic-geenimodifikaatio, yritä toivoa (Zhou et al., 2014). Kohteisiin liittyviä mutaatioita on selitetty pääasiassa CRISPR-genomin modifiointiin ihmisten taudisolujen sisällä, mutta ne voivat lopulta olla harvinaisia hiiren zygootissa (Fu et al., 2013; Yang et al., 2013). Siitä huolimatta kohteen ulkopuoliset mutaatiot ovat edelleen huolenaiheita, kun harkitaan luonnollisesti suunnitellut rottia. Yksittäinen CAS9N -leimaus johtaa yksinkertaisesti yksittäiseen säikeiden taukoon, joka on vaivattomasti korjattu; Joten autenttisen DSB: n tekemiseksi odotetaan pari SGRNA: ta. CRISPR-CAS9 Tekninen on pääosin korvannut geenin, joka keskittyy ES-kudoksiin, koska genomin muokkaaminen tapa rotilla, esimerkiksi keksijäsihisten hiirten saamiseksi tarvittava pienempi päivä.
- Koska Duranin kaupungit hänen päänsä palominon ylin kunnianosoitusreuna, Palomino ei voi asettaa oikeaa yhteyden päähän.
- Innokas ECORI -verkkosivut puuttuvat itse asiassa luovuttaja -DNA: n asentamisesta CRISPR -tuotetun Knockin -hiiren genotyypin mahdollistamiseksi, jossa RE ei leikkaa ki pcr -rengasta.
- Suuret insertiot muuten deleetiot, vaikkakaan ei, saattavat tarvita kaksi SGRNA: ta kokonaan kestoa varten, että genomisen DNA: n koko on joko muutettava tai eliminoida.
- Ehdolliset hiiren tottumukset ovat edullisia ihmisen tilan tutkimuksessa, koska toiset osoittavat fenotyypin samankaltaisuutta, kun olet tietyt perhegeenit poistettavan.
- Ainoastaan yhden DOS -KB: n lisäykset tuotettiin CRISPR: n kanssa pelaamassa, mutta HDR: n tulokset vähenevät olennaisesti, kun upouuden syöttökoon mittaukset laajenevat sen keston ohi.
CAS9: n DNA: n endonukleaasikapasiteetin lisäksi CRISPR: n uudelleensijoitettiin myös RNA -LED -asetuksen aikaansaamiseksi uuden transkriptionaalisen harrastuksen hallitsemisesta keskittyneistä perhegeeneistä. Se saadaan aikaan käyttämällä suurta deaktivoitua CAS9: tä (DCAS9), joka on sulatettu transkriptionaalisiin aktivaattoreille, repressoreille, ja voit epigeneettisiä modifioijia (Komor ym. 2017). Vaihtoehtoisesti kohdegeenin aktivaatio, jolla on pähkinätyyppi CAS9, voidaan saavuttaa myös hauskanpitoon MS2 -hiusneula -aptameereilla rakennettujen kuolleiden SGRNA: ien kanssa.Tällaiset kuolleet SGRNA: t lyhennetään DSB: n luomisen lopettamiseksi, koska MS2 -aptameerit ilmoittavat fuusion välttämättömän proteiinin, joka koostuu uudesta MS2 -bakteriofagipinnoitusproteiineista, jotka on kytketty transkriptionaaliseen aktivaattoriin (Liao et al 2017). Se kohdistuu geenin aktivointimenetelmään on osoitettu hiirten sisällä, jotta voit ajaa suunnattua lausetta perheen geeneistä, jotka on todistettu auttavan parantamaan infektiota esimerkiksi, koska kaikki diabeteksen muodot, munuaisongelma, ja voit lihasdystrofiaa.
Tämäntyyppinen geeni, joka keskittyy tekniikoihin, samoin kuin CRISPR-Cas9-tekniikan mahdollinen kasvu, riittävän lyhyempi aika geneettisesti suunniteltujen rottien viljelyyn 8-kestävistä viikosta, jotta voit 90 päivästä. CRISPR-Cas9-tekniikka sisältää kuitenkin pohjimmiltaan korvattuja ZFN: iä, ja saatat talonit helpon suunnittelun ja rakentamisen suhteen (kuva 1). ZFN: t ja Talens tarvitsevat järjestelmän multimeeristen DNA: n ulkopuolelle liittyvän domeenin nimet tuoretta genomista kohdetta kohti. CRISPR luottaa hyvän ribonukleoproteiinin synteesiin, joka on edistynyt DNA -endonukleaasisi CAS9: n välillä, ja saat suuren ”opas” RNA: n lähettämäsi, jossa tapahtuu erinomaista genomista DSB: tä, jonka kanssa on hauskaa 20BP: n kanssa vastaavasta täydentävästä peräkkäisestä peräkkäisestä.
